polymerase chain reaction (PCR) technology 是一种分子生物学技术,能够迅速高效、定量的扩增出特定的片段,从而得到可用来检测、应用的DNA样本,PCR技术已经成为检测、分析和应用基因的重要工具。
一、基本原理
PCR技术利用DNA的"复制-扩增"的特性,即催化DNA的快速、高效的翻译,从而使特定的靶序列数量增加,靶序列可以是DNA、RNA等。首先,将检测物质中的特定DNA片段(靶序列)在一种叫做复合物(template)的物质中复制拷贝,当复合物变成可分解的碱基链,DNA二核苷酸会结合在靶序列上,形成双链后,复制DNA双链上的每一个反向脱氧核苷酸碱基,使得双链序列能够复制,从而形成一对对照的PCR模板和裂解的DNA,其中一条模板链进行扩增,当碱基凝固在靶序列上后,复杂的PCR反应就开始启动,循环几十次,每次循环完成后,可以扩增出原始特定DNA序列的无数倍,把原本不可见的甚至无法检测到的特定DNA序列变为可以检测到,量也从微量到定量。
二、技术结构
PCR技术主要包括四个基本步骤:新酶的合成(denaturation),链的复制(annealing),多核苷酸的复制(polymerase chain reaction)和表达(expression)。
(1)新酶合成。
新酶合成,首先要使用引物与模板片段结合,从而将它们分解,分解的片段与引物链结合形成一个新的DNA倍体,这叫做新酶合成,将标记物质中精确位置的序列分解,以及新DNA双链链接在一起。
(2)片段连接。
在片段连接过程中,当引物分解完成后,将反向脱氧核苷酸从模板片段中复制,然后以PCR成功性的反应核苷酸结合到模板片段的一端,由可分解特性结合而形成新的PCR模板,使模板两端有了拉伸功能,这样才能复制两个链。
(3)多核苷酸复制
多核苷酸复制主要是利用DNA聚合酶PNK扩增新酶两端拉伸和链接的DNA,多核苷酸CHT结合到第一个脱氧核苷酸碱基上,以利用模板拉伸片段生成新链,从而形成特定靶序列的双链DNA,这样PCR反应就可以反复进行,每一次循环可实现2到4倍的DNA序列的扩增。
(4)表达
最后,在这一步,必须实现PCR模板上扩增产物上表达,多核苷酸CHT分解后释放,释放后形成新的双链DNA,经过几次循环,特定DNA片段可以扩增出足够量的双链DNA,从而进入下一步应用或检测。
三、 适用范围
PCR技术已经应用到医学、基因病理、保健、分子检测、基因分析等领域,广泛应用于抗体制备、膜蛋白分子的研究和鉴定、抗原性测定、基因诊断、分子遗传学、基因组学、转基因植物的分析鉴定等,特别是在生物诊断、特殊感染监
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来源:互联网 / 发布时间:2023-12-29 10:49:49